植物细胞工程思维导图

白兰鸽

2023-04-20

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植物细胞工程

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植物细胞工程

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思维导图大纲

植物组织与器官培养

培养基的成分和作用

概念:培养基是培养植物组织的基质，是植物组织和细胞在离开母体的条件下生存和生长发育所需要的营养来源

培养基的成分决定着植物细胞和组织的生长状况和发育方向

常用培养基种类

MS培养基：1962年为烟草细胞设计

B5培养基：1968年为大豆根细胞设计

White培养基：1943年为番茄细胞设计

Miller培养基：1963年为一般组培设计

N6培养基：1975年组培禾本科植物花药

培养基成分

无机营养

无机元素以无机盐的形式加入到培养基中，在培养基中为离子状态，植物细胞组织吸收的是离子状态的元素。

大量元素: 氮(2-3g)、磷、钾、硫、钙、镁(0.1-0.4g)等

N：硝酸盐 or 铵盐。当作为唯一氮源时，硝酸盐的作用要比铵盐好得多。单独使用硝酸盐，培养基pH值向碱性偏移，加入铵盐可以起缓冲作用。

MS-含有较高浓度和比例的铵态氮；N6-含有高浓度的硝态氮和低比例的铵态氮。

P、K：磷酸钾 or 磷酸二氢钾 Mg、S: 硫酸镁 Ca: 氯化钙

微量元素: 铁、锰、铜、锌、氯、硼等

铁：需求量较大但易沉淀，较难吸收。常用乙二胺四乙酸（EDTA）的钠盐加以螯合保护，以保证铁元素的有效性。

有机营养

糖类

蔗糖(sucrose)、葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)和麦芽糖(maltose)

氨基酸类

脯氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和色氨酸

维生素、醇类等

维生素：硫胺素(维生素B1, thiamine-HCl)（0.1-10mg/L），最为重要。烟酸(尼古丁酸,维生素B3, Nicotinic acid)。泛酸钙(B5, Ca-pantothenate)。吡哆醇(维生素B6, pyridoxine-HCl)等。硫胺素和吡哆醇一般采用盐酸盐的形态，更易溶解。

类微生物：肌醇，在培养基中使用浓度比维生素高,一般100mg/L。

生理活性物质

植物激素，指在自然状态下由植物细胞产生的、对生长发育有显著作用的微量有机物，具有提高细胞活力或改变细胞的发育模式的作用，包括：生长素、细胞分裂素、赤霉素、乙烯等

生长素 (auxin) （0.1-10 mg/L）

天然生长素：吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(indole butyric acid,IBA)。

人工合成生长调节剂：萘乙酸（naphthalene acetic acid, NAA）、二氯苯氧乙酸，=（2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D）、三氯苯氧乙酸（2,4,5-T）等。

细胞分裂素（cytokinin）

天然的：玉米素（Zeatin,ZT）,此外,还有双氢玉米素、异戊烯基腺嘌呤、玉米素核苷、异戊烯基腺苷。

人工合成的分裂素： 6-呋喃甲基腺嘌呤（KT）（又名激动素），玉米素（ZT），6-苄基腺嘌呤（6-BA），噻苯隆（thidiazuron, TDZ) ； TDZ ﹥ ZT﹥6-BA﹥KT

赤霉素（gibberellic acid）——赤霉酸（天然的）(赤霉素A3或GA3)

赤霉素（非离体条件）：促进茎秆的伸长，打破休眠，控制开花，防止落果。

赤霉素（组培）：果树胚珠培养，促进胚胎发育；草莓和马铃薯等的茎尖生长点培养；促进椰菜花的愈伤组织再分化。

脱落酸（abscisic acid，ABA）

脱落酸（非离体条件）：促进休眠，促进衰老和器官脱落，促进气孔关闭，抑制生长。

脱落酸（组培）：抑制未成熟胚的过早萌发，促进胚胎的正常发育；促进番茄，番薯，烟草和水稻的植株再分化；制备人工种子。

乙烯（Ethylene）

乙烯：气态激素。

乙烯（非离体条件）：促进果实成熟和器官脱落等。

乙烯（组培）：应用很少，但密封培养容器内均可检测到乙烯。

其他添加物

固化剂

琼脂（agar），组培常用（6-10g/L），多糖类物质，45℃前后逐渐凝固，易沉底

琼脂糖(agarose)，贵琼脂中不带电荷的中性成份，纯度高、电渗小、凝胶强度高、无色，原生质体包埋培首选材料。

卡拉胶-组培常用（6-8g/L）红藻中提取的海藻多糖，稳定性强，价格低，有利于避免植物材料的玻璃化。植物细胞不能分解或吸收卡拉胶。

Phytagel(植物胶)（1.5-2g/L）由细菌所产生，纯度高、透明度好，凝胶强度大。需要一定浓度的钙离子才能够凝固，在培养水稻植株的后期本来已经固化的培养基会变软甚至液化。

其他：淀粉、明胶

酸碱度调整和稳定剂

酸碱度的调整：1M的 NaOH 或 KOH 和 HCl；稳定（缓冲）剂：MES（2-N-码啉-乙基磺酸），约500mg/L。

渗透压（osmotic potential）调节剂

渗透压调节剂：植物不能进行代谢的物质，如甘露醇(mannitol)和山梨醇(sorbitol)

吸附剂(absorbance) 吸收植物组织分泌到培养基中的有害物质，保护植物组织免受毒害，防止组织褐化。

活性炭(activated charcoal, AC)：一种多孔性的微粒，物理性的吸附作用。加到培养基后可以和外渗物结合，减少外渗物对组织的毒害作用。但活性炭也会吸收植物生长调节剂。

聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrodine, PVP)：PVP 是大分子化合物，具有不同的分子量可供选用，对酚类物质具有专一的吸附能力，在生物化学分离制备中常作为酚类物质和细胞器的保护剂。

抗氧化剂(anti-oxidative) 防止植物材料由于受到损伤而分泌的多酚类物质的氧化产生有毒物质。

按作用机理分成两类，①酚氧化酶抑制物，如:EDTA可以螯合出酚氧化酶中的铜离子从而抑制酶的活性。②影响酚类化合物与酶结合部位的物质，如溜脲、亚硫酸氢钠、二乙基二硫代氨基甲酸钠等。

常用抗氧化剂：柠檬酸、苹果酸、植酸以及维生素C。使用浓度约100-200mg/L, 过滤灭菌后添加到培养基中。

水——占培养基总体积的95%

培养对象不同水质要求不同：①原生质体培养水质要求高；②大量细胞和组织的器官培养水质要求低。培养目的不同对水质要求不同：①科学研究对水质要求高；②组培生产可用自来水。

培养基类型

依培养基配方中含盐量分类：

含盐量较大的培养基：含较高浓度的硝酸盐、铵盐和钾盐，微量元素非常全， MS（Murashige and Skoog于1962）、LS（Linsmaier and Skoog, 1965）、BL(Brown and Lawrence, 1968)、ER(Eriksson, 1965)。

硝酸钾含量较高的培养基：盐浓度高，其中NH4+和PO4-3是由NH4H2PO4提供。 B5（Gamborg等，1968）、N6（朱至清等，1975）、SH（Schenk 和 Hildebrandt，1972）

含盐量中等的培养基：大量元素为MS的1/2，微量元素种类减少，但含量增加，维生素种类比MS的多。 Nitsch（Bourgin 和 Nitsch，1979）培养基

低盐浓度的培养基：White（White，1943）、WS（Wolter and Skoog，1966）、HE培养基（Heller，1953）

一些重要的概念

细胞全能性(totipotency)

是指在多细胞生物中每个体细胞的细胞核具有个体发育的全部基因，具有发育成完整个体的潜力

外植体(explants)

指将用于离体培养的各种植物材料，如组织和器官等。

组织：花药、胚珠、胚、胚乳、形成层等

器官：根、茎、叶、花、果实、种子

愈伤组织(Callus)

指由脱分化后的细胞经过细胞分裂产生无组织结构、无明显极性的松散的细胞团。

脱分化(dedifferentiation)

又称去分化，指已经分化的植物器官、组织或细胞，当受到创伤或进行离体培养时，在一定条件下被诱导改变原有的发育途径，逐步失去原有的分化状态，转变为具有分生能力的胚性细胞的过程。

再分化 (redifferentiation)

器官发生(organogenesis)

诱导器官外植体产生愈伤组织，经分化培养形成芽、根再生成植株的方式。

启动期

愈伤组织诱导

拟分生组织的形成

器官原基和器官的形成

体细胞胚(somatic embryo)

胚状体：又称体细胞胚，是指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物指植物器官、组织和细胞外植体经培养脱分化形成胚状体再成苗的方式。

植物组织培养的一般流程

外植体的选择

原则一：根据具体植物的培养特性

①禾本科植物用种子胚，因为叶片难以形成愈伤组织，再生能力弱； ②草本植物用叶子直接诱导愈伤组织，也可直接形成不定芽或者不定胚； ③木本植物用幼胚诱导愈伤组织，用顶芽或者带有侧芽的节进行芽的增殖。

原则二：根据研究目的

①组织再分化和器官形成：小苗子叶、叶片、胚轴 ②细胞的全能性：单细胞、原生质体 ③快速繁殖：带有多个侧芽的茎段 ④消除病毒：不带或少带侧芽的茎尖

其他策略：用种子进行无菌培养得到小植株，再从小植株获取外植体材料。

采用种子作为材料有如下特点： ①种子可以进行高强度灭菌处理，也可以剥去外壳和种皮后进行培养。 ②当需要根作为外植体材料时，可借助种子萌发获得根。 ③种子的基因型和母体基因型可能不一样，种子存在休眠期需打破休眠。

外植体的处理

目的：改变外植体的生理状态

有季节性休眠的，需打破休眠，鳞茎植物可采用低温预处理。花药培养，培养前需进行低温处理,可提高愈伤组织形成率。采用适当高温处理，使某些病毒分子降解或失活，从而扩大没有病毒的茎尖区域，方便培养。

灭菌：目的：杀灭附着在外植体表面或表层细胞中的微生物，但不包括病毒、内生菌——次氯酸钠

对付病毒和内生菌的办法

①常规表面灭菌后进行茎尖培养； ②采用能够渗透进组织内的抗生素类药物进行内部灭菌处理。

抗生素的使用：通常是将抗生素经过过滤灭菌后加到培养基中，然后将外植体培养到培养基上。

外植体的取材

春天和晚秋取材。连续多天的晴天后进行。注意取材时不要切得太短。要注意保湿和降温。取回后一般是尽快使用（或4-8℃的低温保存）

茎尖、茎段、皮层、表皮、块茎、花瓣、根、叶、子叶、鳞茎、胚珠、花药等

人工种子与植物脱毒

植物细胞与原生质体培养与诱变

植物细胞培养及次级代谢产物制备

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