基因工程思维脑图思维导图

柯柯

2024-05-27

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基因工程

操作程序

应用实验

定义，基本工具，操作程序等内容讲解

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思维导图大纲

定义

指按照人们的愿望,通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。原理：基因重组。

基本工具

限制性内切核酸酶（限制酶）

实质：能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。

来源：主要是从原核生物中分离纯化出来。

EcoRⅠ限制酶：产生黏性末端。SmaⅠ限制酶：产生平末端。

DNA连接酶

E.coliDNA连接酶：从大肠杆菌中分离出来的，连接具有互补黏性末端的DNA片段。

T4DNA连接酶：从T4噬菌体中分离出来的，既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端（效率相对较低）。

载体

种类：质粒（质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子）、噬菌体、动植物病毒等。

作用：①作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中；②能在受体细胞内对目的基因进行大量复制。

需具备的条件：①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。②具有一个或多个限制酶切点，供外源DNA片段（目的基因）插入其中。③具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。④必须是安全的，对受体细胞无害。

基本操作程序

目的基因的筛选与获取（前提）

目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指编码蛋白质的基因。

筛选方法：①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选；②测序技术、遗传数据库、序列比对工具等技术的应用。

PCR

全称：聚合酶链式反应。含义：是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。基本条件：DNA母链，4种脱氧核苷酸，耐高温的DNA聚合酶，两种引物（短单链核酸），缓冲溶液，Mg²⁺

过程：变性（温度超过90°C，双链DNA解聚为单链）→复性（温度下降到50°C左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合）→延伸（温度上升到72°C左右，4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链）；成指数形式扩增。

常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。

基因表达载体的构建（核心）

构建目的：让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时使目的基因能够表达和发挥作用。

组成：目的基因、标记基因（鉴定受体细胞中是否含有目的基因）、启动子（位于基因上游，紧挨转录的起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位）、终止子（位于基因下游，使转录在所需要的地方停下来）、复制原点。

将目的基因导入受体细胞（关键，也是唯一不涉及碱基互补配对原则的步骤）

植物

花粉管通道法：受体细胞为受精卵，为我国独创。

农杆菌转化法

受体细胞：受精卵或体细胞。

转化：指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

过程中：两次拼接，两次导入。（各有一次非人工操作）

动物

显微注射法：受体细胞为动物的受精卵（或胚胎干细胞，均有细胞全能性）。

微生物

Ca²⁺处理法（或感受态细胞法）：用Ca²⁺处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种状态称为感受态，处于感受态的细胞就是感受态细胞。

目的基因的检测与鉴定（保证）

检测目的：检测目的基因进入受体细胞后是否维持稳定和表达其遗传特性。

应用

农牧业方面

转基因抗虫植物、转基因抗病植物、转基因抗除草剂植物、改良植物的品质（营养价值、观赏价值）。

①提高动物的生长速率（将外源生长激素基因导入鲤鱼）；②改良畜产品的品质（肠乳糖酶基因，降低乳糖含量）。

医药卫生领域

乳腺生物反应器（也叫乳房生物反应器）的要求：雌性，处于泌乳期才能收集药物；膀胱生物反应器：不受性别和年龄的限制，周期短，易收集和提纯更高。

器官移植

选择猪（需转基因）的原因：①目前，人体移植器官短缺是一个世界性难题；②猪的内脏构造、大小、血管分布与人极为相似； ③猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒远远少于灵长类动物。

食品工业方面

基因工程菌：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类。

利用基因工程菌生产食品工业用酶（凝乳糖酶、淀粉酶、脂肪酶。还利用了发酵工程）、氨基酸和维生素等。还可以培育出“超级细菌”来处理环境污染......

实验

DNA的粗提取与鉴定

粗提取：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精（可初步分离DNA与蛋白质）。DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，能溶于2mol/L的NaCl溶液。

鉴定：在一定温度（沸水浴）下，DNA遇二苯胺试剂（现配现用）会呈现蓝色。蓝色深浅与DNA含量的多少有关。

过程：取材——研磨——过滤——析出——鉴定。

DNA片段的扩增及电泳鉴定

扩增

原理：①利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。②PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚（主要破坏氢键）与结合。③PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。

过程：准备——移液——离心——反应。（预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合）

电泳鉴定

原理：①DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 ②在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 ③凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。

过程：配制琼脂糖溶液——制备凝胶——加样——电泳——观察结果。（荧光强度与DNA含量的多少呈正相关）

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