1. CYB5R4 在急性肾损伤近端肾小管上皮间充质转化中的表达及作用
（1）选用雄性 C57BL/6J 野生型（WT）小鼠、CYB5R4 过表达小鼠及 CYB5R4 敲低小鼠，分别构建AKI小鼠（UUO、IRI、CLP、LPS等）模型；同时，体外培养肾小管上皮细胞（HK-2 细胞），并构建 CYB5R4 过表达及 CYB5R4 敲低的 HK-2 细胞系，通过缺氧处理或毒素刺激模拟急性肾损伤状态。
（2）运用免疫组织化学、免疫荧光、Western blot 和实时定量 PCR 等技术，检测 CYB5R4 在正常及损伤条件下的 mRNA 和蛋白表达水平变化；测定近端肾小管损伤标志物（KIM-1、NGAL）、细胞凋亡因子（Bax、Caspase-3）以及上皮细胞标志物（例如cytokeratins和 E-cadherin）、间充质细胞标志物（例如 N-cadherin、vimentin和纤连蛋白）的表达。结合肾脏病理学检查，如 HE 染色、Masson 染色，评估肾脏病理损伤和纤维化程度，深入分析 CYB5R4 表达变化与肾脏病理损伤之间的关系。
2. 阐明 Rbx1 是 CYB5R4 调控急性肾损伤近端肾小管上皮间充质转化的关键分子
（1）采用免疫共沉淀（Co-IP）实验，探究 CYB5R4 与 Rbx1 之间是否存在直接的蛋白相互作用。
（2）在已构建的AKI小鼠（UUO、IRI、CLP、LPS等）模型，以及体外培养的 HK-2 细胞缺氧或毒素刺激模型中，同步检测 Rbx1 的表达水平及组织定位，分析其与 CYB5R4 表达变化及 EMT 进程的关联性。
（3）体外培养 HK-2 细胞，构建 CYB5R4 过表达及干扰的稳定转染细胞株，同时过表达或沉默 Rbx1，检测近端肾小管损伤标志物、细胞凋亡因子以及上皮细胞标志物、间充质细胞标志物的表达变化，明确 Rbx1 在 CYB5R4 调控 EMT 过程中的介导作用。
3. 探索 CYB5R4 对 Rbx1 水平的影响进而通过 Smad2/3 的泛素化缓解急性肾损伤近端肾小管上皮间充质转化
（1）在AKI小鼠（UUO、IRI、CLP、LPS等）模型以及体外培养的 HK-2 细胞缺氧或毒素刺激模型中，分析 TGF-β、Smad2/3、u-Smad2/3 的表达水平与 CYB5R4、Rbx1 表达的相关性。
（2）体外培养 HK-2 细胞，构建 CYB5R4 过表达及干扰的稳定转染细胞株，同时过表达或沉默 Rbx1，检测 Smad2/3 的泛素化修饰情况，研究 Rbx1 在 CYB5R4 调控 Smad2/3 转录活性中的作用机制。
（3）用Smad2/3 特异性抑制剂，将其与CYB5R4 和Rbx1过表达或敲低载体联合转染 HK - 2 细胞，然后进行 H/R 处理。检测 EMT 相关指标，分析 Rbx1/Smad2/3 信号轴在 CYB5R4 调控急性肾损伤近端肾小管上皮间充质转化过程中的作用机制。
