BMAL1通过HIF-2α/p53信号轴抑制铁死亡减轻脓毒症ARDS的作用机制思维导图

U555399010

2025-07-13

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细胞模型

实验分组

机制检测

机制验证实验，干预分组，模型建立相关内容讲解

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思维导图大纲

细胞模型建立与干预分组

细胞类型

原代人肺微血管内皮细胞（HPMVECs）

脓毒症模拟方式

使用脂多糖（LPS）刺激

干预分组

对照组（Control）

LPS刺激组（LPS）

LPS+siBMAL1

LPS+BMAL1过表达组（OE-BMAL1）

LPS+HIF-2α抑制剂组（PT2385）

预实验组：LPS+siCtrl、LPS+空载体组（正式实验中删除）

机制验证实验

BMAL1对HIF-2α的调控作用

转录调控分析

ChIP-qPCR检测BMAL1是否结合HIF-2α启动子区

建议覆盖潜在E-box区域（如CACGTG）

可使用JASPAR数据库预测结合位点或参考文献设计引物

控制组包括IgG对照和不同处理组（Control,LPS,LPS+OE-BMAL1）

蛋白表达分析

Westernblot检测HIF-2α蛋白水平

分组：Control、LPS、LPS+OE-BMAL1、LPS+PT2385

qPCR检测HIF-2αmRNA水平（Control、LPS、LPS+OE-BMAL1）

蛋白稳定性验证

Co-IP检测BMAL1与HIF-2α相互作用（免标签Co-IP）

分组：Control、LPS、OE-BMAL1、PT2385

WB检测HIF-2α±MG132处理，分组：Control, LPS, LPS+OE-BMAL1，评估泛素化降解情况

HIF-2α对p53活性的抑制作用

p53活性检测

WB检测Ac-p53（K382）、p-p53（Ser15）、otal p53修饰水平

使用荧光素酶报告基因检测p53转录活性

分组：LPS、LPS+PT2385、OE-BMAL1

竞争性结合验证

Co-IP检测HIF-2α与p53的相互作用

分组：LPS、LPS+PT2385、LPS+OE-BMAL1

设置IgG阴性对照

p53下游铁死亡通路检测

关键分子表达

WB检测SLC7A11、GPX4蛋白水平

分组：LPS、OE-BMAL1、PT2385

铁死亡直接标志物

电镜观察LPS, LPS+OE 线粒体嵴消失/膜密度增加

C11-BODIPY检测脂质ROS水平（流式或显微成像）（LPS, OE-BMAL1, PT2385)

MDA比色法或 BODIPY581/591 C11荧光探针替代MDA LPS，OE-BMAL1，PT2385

氧化还原状态检测

GSH/GSSG比值检测

分组：LPS、LPS+OE-BMAL1

死亡方式鉴别

流式AnnexinV/7-AAD双染排除凋亡干扰

分组：LPS、LPS+OE-BMAL1

Ferrostatin-1干预验证铁死亡特异性

细胞功能表型检测

内皮屏障功能

ZO-1免疫荧光定位检测紧密连接结构

Transwell检测FITC-葡聚糖通透性

分组：Control、LPS、LPS+OE-BMAL1

动物模型构建与实验分组

模型选择与手术操作

使用CLP诱导脓毒症ARDS

构建内皮特异性BMAL1敲除小鼠（Bmal1fl/fl;Cdh5-CreERT2）

实验动物与分组

Sham组（Bmal1fl/fl无Cre小鼠）

CLP组（Bmal1fl/fl无Cre小鼠）

CLP+Endo-BMAL1KO组（Bmal1fl/fl;Cdh5-CreERT2小鼠）

CLP+Endo-BMAL1KO+Ferrostatin-1组（Fer-1）

基因敲除策略

使用Bmal1flox/flox;Cdh5-CreERT2小鼠

Tamoxifen诱导内皮特异性敲除

自繁小鼠，仅购买Tamoxifen

铁死亡抑制剂应用

Ferrostatin-1腹腔注射

表型与机制检测

肺损伤评估

病理学分析

H&E染色评估肺泡结构破坏与炎症浸润

肺损伤评分（代表性切片）

肺水肿评估

肺湿/干重比测定（右肺中叶）

分组：Sham、CLP、CLP+Endo-BMAL1KO、CLP+KO+Fer-1

铁死亡标志物检测

脂质ROS检测

C11-BODIPY冰冻切片荧光检测

分组：CLP+Endo-BMAL1KO、CLP+KO+Fer-1

WB检测关键蛋白

同一膜连续检测BMAL1、GPX4（StripingBuffer重复利用）

分组：CLP（无Cre）、CLP+Endo-BMAL1KO、CLP+KO+Fer-1

BMAL1-HIF-2α-p53信号轴验证

免疫组化/免疫荧光

单张切片三重染色：BMAL1/HIF-2α/Ac-p53+CD31

分组：Sham（无Cre）、CLP（无Cre）、CLP+Endo-BMAL1KO、CLP+KO+Fer-1

多重qPCR检测

两轮检测：BMAL1+GAPDH，HIF-2α+SLC7A11

分组：Sham（无Cre）、CLP（无Cre）、CLP+Endo-BMAL1KO、CLP+KO+Fer-1

免疫荧光阴性对照设置

一抗空白对照（不加BMAL1/HIF-2α/Ac-p5 3抗体）

Cre阴性对照组Bmal1fl/fl无Cre小鼠的CLP 组（排除Tamoxifen和手术影响）

Co-IP体内互作验证

使用冻存肺组织裂解液进行内源Co-IP

检测CLPvsCLP+KO组HIF-2α与p53相互作用

或改为GSTpull-down体外验证降低成本

生存率分析

记录各组48小时生存率

显示KO组死亡率升高及Fer-1挽救效果

临床研究部分

样本来源与分组

脓毒症ARDS组：20例ICU确诊患者（PaO₂/FiO₂<200）

BALF样本采集用于机制验证

分层标准

ARDS严重度按柏林标准分层（轻/中/重度）

临床结局指标：28天死亡率、机械通气时间、SOFA评分等

必检指标

BALF中BMAL1、HIF-2α、SLC7A11、GPX4mRNA表达

BALF上清中GDF-15、MDA（ELISA）

临床关联分析

分子标志物与PaO₂/FiO₂、SOFA评分相关性

与机械通气时间、死亡率等硬终点关联分析

904名中国成年人第三磨牙相关知识、态度、行为和病史的横断面调查思维导图

U633687664

3.9

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9.战斗的基督教思维导图

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3.63

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