生物化学第三章酶的提取与分离纯化知识清单思维导图

U629353324

2023-03-19

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生物化学

酶工程

酶

生物化学第三章酶的提取与分离纯化知识清单

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思维导图大纲

细胞破碎

酶的存在形式

胞外酶

分泌到培养基中

胞内酶

需细胞破碎

通过各种方法使细胞外层结构被破坏、细胞内溶物被释放出来的过程。

方法（作用原理）

机械法

依靠机械运动产生的剪切力使细胞破碎

实验室常用

捣碎法

研磨法

匀浆法

工业

高压匀浆法

细胞悬浮液快速通过节流孔或针形阀，骤然减压赫高速冲击撞击环，细胞迅速膨胀，同时受剪切作用破碎

易产生大量的热

物理法

温度、渗透压、超声波等物理作用

冻融法

热胀冷缩，冷冻时产生的冰晶

效率较低

渗透压冲击法

预先经高渗处理的细胞，在低渗环境中大量吸收水分

革兰氏阴性菌细胞周质酶的释放

超声波破碎法

“空化”作用，超声波在溶液中激发微小气泡，气泡长大、破碎使长生冲击波赫剪切力

操作简便、快捷，放热量大

容易产生活性氧而使酶变性

实验室小规模使用

化学法

酸、碱、有机试剂、表面活性剂等改变细胞壁或细胞膜的通透性而使细胞破碎

有机溶剂能溶解磷脂，破坏细胞膜的磷脂双分子层结构，改变细胞通透性，适用于膜结合酶的提取

酶解法

利用酶制剂的催化作用，使细胞壁溶解，释放细胞内溶物

不同类型细胞根据细胞壁的成分和结构，选择相应的酶制剂

Gram+ 溶菌酶肽聚糖

Gram- 溶菌酶+EDTA

酵母菌蜗牛酶葡聚糖和甘露聚糖等

霉菌几丁质酶

植物细胞纤维素酶+果胶酶

效率较高，价格昂贵，难以大规模使用

酶的初步分离

沉淀分离

改变某些条件或加入某种物质，使酶的溶解度降低，从溶液中沉淀析出

盐析沉淀

原理

中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，破坏蛋白质水化层

盐离子中和Pro表面电荷，降低蛋白溶解度

还须通过透析、超滤或层析等方法脱盐

等电点沉淀

酶蛋白在等电点时溶解度最低

不同酶蛋白有不同等电点

常与盐析沉淀法一起使用，获得较完全的沉淀效果

聚合物沉淀

聚合物与酶的交缠、聚集导致共沉淀

亲水性聚合物使酶蛋白表面脱水而聚集沉淀

聚合物与酶蛋白形成庞大的复合物，在重力作用下沉淀

选择性变性沉淀

加热、改变pH、加入某些金属离子等，使杂蛋白沉淀

适用于某些耐热、耐酸碱、对金属离子不敏感的酶

离心分离

借助于离心机高速旋转所产生的离心力，使不同大小、密度的物质分离

酶与细胞破碎液分离

低速或高速离心机

分离两种以上大小和密度不同的颗粒

差速离心法

超速离心机

差速离心、密度梯度离心、等密度梯度离心等

离心效果的影响因素

离心机类型

离心方法

离心力（离心速度）

离心时间

离心机工作温度

其他参数选择

离心时间与颗粒大小有关

小颗粒沉降速度慢，离心时间长

绝大多数酶对温度敏感

一般控制4℃左右在

过滤与膜分离

过滤

借助一定的介质进行固液分离，以截留特定大小颗粒

以膜为过滤介质

先用截留直径为0.2μm的微滤膜滤除细菌、灰尘、细胞碎片等微笑颗粒物

微滤之后的粗酶液可直接用于层析分离纯化或超滤法大分子分级

超滤

截留直径为2~200nm，相当于相对分子质量 1~500kDa

主要用于分离病毒和各种生物大分子，脱盐、浓缩、缓冲液置换等

流率表示超滤膜通过性（每平方厘米的膜每分钟透过的流体体积）

流率与膜外径、颗粒形状、大小、溶液浓度、操作压力等因素相关

压力一般控制在0.1~0.7MPa之间

透析

小分子物质的扩散作用，使其不断透过半透膜扩散到膜外，大分子物质被截留

操作简单，效率较低

对酶液造成稀释作用，需要浓缩

电渗析

同时利用酶蛋白的电荷性质和分子大小差异

阳离子向负极移动，透过半透膜进入阴极槽

阴离子向正极移动，透过半透膜进入阳极槽

大于半透膜孔径的物质被截留

用于粗酶液的脱盐

酶的浓缩、结晶与干燥

浓缩

从低浓度酶液中除去部分水或其他溶剂而成为高浓度酶液

酶蛋白的浓缩方法

超滤膜分离

离子交换层析及亲和层析

加入吸水剂（硅胶、聚乙二醇等）

蒸发浓缩

真空条件，温度条件在60℃下进行

真空度越高，蒸发浓度越低，越有利于酶活性保持

真空条件对设备的要求高

结晶

以晶体的形式从溶液中析出

结晶过程具有排他性

获得高纯度酶

结晶之前酶液应的达到较高纯度，易结晶

浓、纯度越高越容易结晶

浓度过高易形成小晶核

酶液浓度控制在稍过饱和状态，控制高温度、 pH、离子强度

方法

盐析结晶

在适当的温度和pHT条件下，于接近饱和的酶液中缓慢增加硫酸钠等中性盐的浓度使酶的溶解度缓慢降低，析出酶晶体

将饱和盐溶液缓慢滴加到浓酶液中

稍微出现浑浊时，静置，缓慢析晶

缓慢匀速补加饱和盐溶液，直至结晶完全

有机溶剂结晶法

含盐少，结晶时间短

操作在低温下进行

等电点结晶

酶在等电点时呈中性溶解度最低

缓慢改变浓溶液pH使之逐步达到酶的等电点

调节pH要缓慢均匀，避免局部过酸过碱影响结晶

可与透析结合

用一定pH的缓冲液进行透析

酶液pH逐渐接近酶的等电点而结晶

干燥

通过气化，使浓酶液中的水分或其他溶剂被去除，从而制得固体酶制剂的过程

方法

真空干燥法

较高真空度的密闭干燥器

蒸发干燥可适当加热

温度一般不能超过60℃

对热敏感的酶一般不采用此法

冷冻干燥法

最常用最重要

将酶冷冻成固态，置于-50℃以下高真空条件

冰直接升华成气体，得到干燥的酶制剂

特别适用于对热敏感的酶

酶结构完整，活力损失小，质量好

成本、能耗高

喷雾干燥法

通过雾化器的作用，将酶液喷洒成极细的雾状液滴并分散于热气流中，水分迅速蒸发而得到粉末状的干燥酶制剂的过程

被雾化成直径几十微米的液滴，比表面积大，水分蒸发迅速

只需几秒到几十秒即可干燥完毕

温度较低，产品纯度较高

操作简单，适宜于连续化生产

目标酶提取

在适宜条件下，用合适的溶剂处理发酵液或破胞液，使酶溶解的过程

实验室常用方法

盐溶液提取

酸提取

碱提取

有机溶剂提取

依据：酶的结构和溶解性质

“相似相溶”原理，以水溶液为主要溶剂

盐的浓度应控制在低浓度

根据酶的等电点选择偏酸或偏碱性溶液来溶解

酶的提取效果

溶解度

扩散速率

温度

适当提高T可增大酶的溶解度和扩散速率

过高使酶变性失活

影响酶分子的解离状态及酶的溶解度

避开酶的等电点，防止酶聚集沉淀

提取液体积

增加用量，提高酶提取率，但降低了酶浓度

一般：提取液总体积为原料液体积的~倍，并多次提取

避免酶失活方法

适当加入保护剂，提高其稳定性

抗氧化剂

辅酶

酶作用的底物

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