1.用枪头挑取单克隆菌落,投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。(同时做培养基和枪头的空白对照)
2.37℃,220rpm,培养14-16个小时医|学教育网搜集整理。
3.第二天,以1:100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中,37度,220rpm,振摇2-3小时,每半小时测一次OD,当OD值达到0.3-0.4时,停止培养。
4.将菌液在冰上预冷30分钟,随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中,4℃,2500rpm离心10分钟。
5.弃上清,离心杯中加入少量ddH2O,使沉淀悬浮后,再将水注满离心杯,4℃,4000rpm离心10分钟。
6.弃上清,加少量灭菌水,重悬菌体,再将水注满离心杯,4000rpm,4℃,离心10min.
7.弃上清,往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌,预冷),重悬菌体,再加满10%甘油, 4℃, 4000rpm, 离心10min.
8. 弃上清,每个离心杯中加入5ml10%的甘油,使沉淀悬浮后,将菌液以300ul/管分装于1.5ml的离心管中,-80 ℃冰箱中保存。同时取100 μl感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化,检测转化效率。