包虫病诊断标准附录C思维导图

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2023-02-20

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公共卫生知识

卫生标准

传染病卫生标准

包虫病诊断标准

附录C

免疫学诊断方法

包虫病诊断标准附录C：免疫学诊断方法人体包虫病免疫学诊断方法有间接红细胞凝集试验（IHA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、PVC薄膜快速ELISA等。其中，以ELISA法最为常用且较敏感。现有的包虫病免疫学试验方法在敏感性和特异性上存在很大的差异。

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思维导图大纲

C.1 抗原制备

C.1.1囊液粗抗原：完整的棘球蚴组织表面清洗干净消毒后，无菌抽取囊液（宜使用无化脓和无钙化的可育囊）。将囊液经5000 r/min离心20 min，上清液冻存备用。

C.1.2 纯化抗原

可用磷钨酸、氯化镁沉淀法对棘球蚴囊液抗原进行部分纯化。取20ml离心后的囊液上清，加入2mol/L MgCl2和4%磷钨酸（用NaOH调节pH至7.5～7.6）各1.2ml；室温搅拌5 min，5000r/min 离心30 min；将沉淀用0.02mol/LpH7.2 PBS溶解；4oC 透析24小时，测定蛋白浓度，～20 oC冻存。

C.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）

C.2.1 抗原

囊液粗抗原、纯化抗原、特异性抗原。

C.2.2 操作方法

C.2.2.1 抗原包被：用0.05 mol/L pH9.6碳酸缓冲液稀释抗原至工作浓度，每孔加入100 μl，置温盒4℃过夜。次日，倾去抗原，用含0.05%吐温～20的磷酸盐缓冲液（0.02mol/L .pH7.4 PBST）洗涤3次，每次3 min，拍干；

C.2.22 加待检血清：血清用含3%BSA的PBST 1∶200稀释，每孔加入100 μl，每板应设参考阳性一孔，参考阴性三孔及PBS对照一孔。置温盒，37℃ 1 h，取出倾去血清，同前洗涤3次；

C.2.2.3加酶标记第二抗体：加入工作浓度的辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗人IgG 100 μl，37℃，1 h，倾去第二抗体，同前洗涤；

C.2.2.4 加底物显色：加邻苯二胺（OPD，橙红色）或四甲基胺/四甲基联苯胺硫酸盐（TMB/TMBS，蓝色）底物溶液100 μl，37℃，30 min；

C.2.2.5 加终止液：2 mol/L . H2SO4 50 μl.

C.2.3 结果判断

在酶标仪上读取492 nm（OPD）或450 nm（TMB/TMBS）吸光值，以待测样本（S）对阴性对照血清（N）的S/N≥2.1为阳性临界值。

C.3 间接红细胞凝集试验（IHA）

C.3.1 红细胞醛化

C.3.1.1 从绵羊颈静脉无菌采血100ml，加入200ml～400ml阿氏液（400ml三蒸水中溶解葡萄糖8.2g、NaCI 1.68g、柠檬酸三钠2.4g和柠檬酸0.22g，调pH至6.1，高压或过滤除菌）中，混匀抗凝。3000 r/min离心15 min，弃上清；

C.3.12 用生理盐水洗涤红细胞3次，同上离心。沉淀中加入50ml生理盐水和100ml PBS（0.15 mol/L ，pH8.0）混匀；

C.3.13 加入经10% Na2CO3中和的戊二醛300ml（10% Na2CO3 75ml与25%戊二醛225ml混合）于磁力搅拌器4℃缓慢搅拌24 h；

C.3.14+ 离心弃上清，沉淀用生理盐水洗涤5次。最后，将红细胞沉淀用含0.1% NaN3的生理盐水配成10%细胞悬液，4℃保存。

C.3.2 红细胞致敏

C.3.2 1.将10%戊二醛醛化的绵羊红细胞20ml 用生理盐水300ml 洗3次（3000 r/min，5 min），红细胞压积约为2ml；

C.3.2 .2加入生理盐水98ml，将红细胞配成2%悬液100ml；

C.3.2. 3与1：10000鞣酸100ml混合于37 oC水浴30 min，每10 min混旋一次；

C.3.2. 4同步骤1离心洗3次，弃上清；

C.3.2. 5沉淀加入生理盐水198ml，将鞣化红细胞配成1%悬液200ml；

C.3.2. 6.与稀释好的囊液抗原200ml 混合，37 ℃水浴30 min，每10 min混旋一次；

C.3.2. 7离心弃上清，用1%兔血清PBS（0.15 mol/L pH7.2 PBS）洗3次，弃上清；

C.3.2. 8 用10%兔血清PBS 18ml将红细胞配成10%致敏红细胞20ml.置4℃冰箱保存。

C.3.3 操作方法

C.3.3.1 准备抗原：用0.15 mol/L pH7.2 PBS将10%致敏红细胞保存液稀释至1%备用；

C.3.3.2血凝板每孔加入25 μl PBS；

C.3.3.3第一孔加入待检血清25 μl，用移液器或稀释棒从第一孔开始逐孔向后稀释；

C.3.3.4每孔加1%致敏红细胞25 μl，振荡混合3 min，置37℃反应1h，判定结果；

C.3.3. 5.对照设置：每批试验均应设置阳性、阴性和红细胞对照（红细胞对照孔只有PBS和致敏红细胞）。

C.3.4 结果判断

C.3.41 阴性反应：红细胞全部沉入孔底呈点状，边缘光滑；

C.3.42阳性反应：＋＋＋＋ 100%红细胞凝集；＋＋＋ 75%红细胞凝集；＋＋ 50%红细胞凝集；＋ 25%红细胞凝集。

以血清1∶128稀释出现阳性反应者（++）判为血清抗体阳性。

C.4 PVC薄膜快速ELISA

C.4.1 抗原

囊液粗抗原、纯化抗原、特异性抗原

C.4.2 操作方法

C.4.2.1 取已包被好抗原的PVC薄膜软板，编号，用PBST洗1次，然后每孔加PBST 200 μl；

C.4.2.2 加待检血清及参考血清（每板作阴性对照一孔、阳性对照一孔）每孔10 μl，混匀，置湿盒37℃ 5 min（或25℃室温10 min）。倾去血清，用PBST连续洗8次，甩干；

C.4.2.3加酶标抗体：每孔加工作浓度酶标抗体 200 μl，37℃ 5 min，同上洗涤8次，再加蒸馏水洗一次，甩干；

C.4.2.4 加底物显色：每孔加TMB底物200 μl，反应5 min～10 min（TMB底物溶液的制备：TMB 50 mg溶于10ml二甲基亚砜中作为母液，4℃保存。用前取母液1ml＋pH 5.0柠檬酸缓冲液50ml＋30% H2O2 8 μl）。

C.4.3 结果判断

参照阴性及阳性对照，用目视法判断结果。阴性基本无色，阳性为鲜蓝色。

C.5 免疫印迹技术（Western blot，WB）

C.5.1 抗原膜制备

C.5. 2 操作方法

C.5.2.1 将抗原膜置于反应槽中，加入用封闭液（3 %脱脂奶粉，0.15 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，pH 7.4，0.02%吐温～20）1：100稀释的待检血清，每批试验应设参考阳性、阴性和PBS对照。室温振摇2 h（4℃可过夜）。次日，用上述封闭液洗4次，每次5 min；

C.5.2.2加入工作浓度的辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗人IgG，室温2 h，同前洗涤；

C.5.2.3加入二氨基联苯胺（DAB，棕色）显色至清晰后，蒸馏水终止反应，将反应膜干燥保存。

C.5.3 判读结果

细粒棘球蚴特异性反应条带：8 kDa、16 kDa、20-24 kDa（AgB）和38 kDa（Ag5）

多房棘球蚴特异性反应条带：18 kDa（Em18）、54 kDa（Em2）和220 kDa（EmAP）