脂肪酸β氧化过程可概括为活化、转移、β氧化及最后经三羧酸循环被彻底氧化生成CO2和H2O并释放能量等四个阶段。
（1）脂肪酸的活化：脂肪酸的氧化首先须被活化，医学教育/网搜集整理在ATP、Co-SH、Mg2+存在下，由位于内质网及线粒体外膜的脂酰CoA合成酶，催化生成脂酰CoA.活化的脂肪酸不仅为一高能化合物，而且水溶性增强，因此提高了代谢活性。
（2）脂酰CoA的转移脂肪酸活化：是在胞液中进行的，而催化脂肪酸氧化的酶系又存在于线粒体基质内，故活化的脂酰CoA必须先进入线粒体才能氧化，但已知长链脂酰辅酶A是不能直接透过线粒体内膜的，因此活化的脂酰CoA要借助肉碱（camitine），即L-3羟-4-三甲基铵丁酸，而被转树图思维导图原创运入线粒体内，在线粒体内膜的外侧及内侧分别有肉碱脂酰转移酶I和酶Ⅱ，两者为同工酶。位于内膜外侧的酶Ⅰ，促进脂酰CoA转化为脂酰肉碱，后者可借助线粒体内膜上的转位酶（或载体），转运到内膜内侧，然后，在酶Ⅱ催化下脂酰肉碱释放肉碱，后又转变为脂酰CoA.这样原本位于胞液的脂酰CoA穿过线粒体内膜进入基质而被氧化分解。一般10个碳原子以下的活化脂肪酸不需经此途径转运，而直接通过线粒体内膜进行氧化。
（3）脂酰CoA的β氧化：脂酰CoA进入线粒体基质后，在脂肪酸β氧化酶系催化下，进行脱氢、加水，再脱氢及硫解4步连续反应，最后使脂酰基断裂生成一分子乙酰CoA和一分子比原来少了两个碳原子的脂酰CoA.因反应均在脂酰CoA烃链的α，β碳原子间进行，最后β碳被氧化成酰基，故称为β氧化。
a 脱氢：脂酰CoA在脂酰基CoA脱氢酶的催化下，其烃链的α、β位碳上各脱去一个氢原子，生成α、β烯脂酰CoA（trans-y-enoylCoA），脱下的两个氢原子由该酶的辅酶FAD接受生成FAD.2H.后者经电子传递链传递给氧而生成水，同时伴有两分子ATP的生成医学教育/网搜集整理。
b 加水：α、β烯脂酰CoA在烯酰CoA水合酶的催化下，加水生成β-羟脂酰CoA（βhydroxyacylCoA）。
c 再脱氢：β-羟脂酰CoA在β-羟脂酰CoA脱氢酶（L-βhydroxyacylCoAdehydrogenase）催化下，脱去β碳上的2个氢原子生成β-酮脂酰CoA，脱下的氢由该酶的辅酶NAD+接受，生成NADH＋H+.后者经电子传递链氧化生成水及3分子ATP.d 硫解：β-酮脂酰CoA在β-酮脂酰CoA在硫解酶（β-ketoacylCoAthiolase）催化下，加一分子CoASH使碳链断裂，产生乙酰CoA和一个比原来少两个碳原子的脂酰CoA.以上4步反应均可逆行，但全过程趋向分解，尚无明确的调控位点。
1分子软脂酸含16个碳原子，靠7次β氧化生成7分子NADH+H+，医学教育/网搜集整理7分子FADH2，8分子乙酰CoA，而所有脂肪酸活化均需耗去2分子ATP.故1分子软脂酸彻底氧化共生成：7×2+7×3+8×12-2＝129分子ATP。
